Die Handlung spielt im Jahr 1968 und damit acht Jahre nach dem Ende von BioShock. Rapture wird nun von Sofia Lamb geleitet, welche von der Idee besessen ist, den menschlichen Egoismus abzuschaffen. Der Spieler übernimmt die Rolle des ersten funktionstüchtigen Prototypen eines Big Daddys namens Delta, der sich den fortwährenden Aggressionen Lambs ausgeliefert sieht. Er ist auf der Suche nach seiner einstigen Little Sister Eleanor, die zugleich Lambs Tochter ist. Sofia hatte sie ihm noch vor Ausbruch des Bürgerkriegs in Rapture entwendet und ihn zum Selbstmord gezwungen. Jahre später gelingt es der inzwischen erwachsenen Eleanor jedoch, Delta ins Leben zurückzuholen. Durch die einprogrammierte, starke Bindung eines Big Daddys an seine Little Sister muss Delta den Kampf gegen Lamb aufnehmen und Eleanor befreien, um am Leben zu bleiben.